Исследователи из Института Хабрехта разработали новый генетический инструмент для маркировки определенных генов в органоидах человека или мини органах. Они использовали новый метод CRISPR-HOT, чтобы изучить, как делятся гепатоциты и как появляются аномальные клетки с избыточным ДНК. Отключив раковый ген, ученые продемонстрировали, что неструктурированное деление аномальных гепатоцитов учащается, что может способствовать развитию рака. Результаты их работы были описаны и опубликованы в научном журнале «Nature Cell Biology».
Органоиды – мини органы, которые могут быть выращены в лаборатории. Они образуютсяиз очень маленьких кусочков ткани. Способность генетически изменять органоиды может помочь в изучении биологических процессов и моделировании заболеваний. Однако до сих пор получение генетически измененных человеческих органоидов считалось сложной задачей.
CRISPR-HOT
Несколько лет назад исследователи обнаружили, что CRISPR/Cas9, который, подобно крошечным молекулярным ножницам, может разрезать определенные места в ДНК. Эта технология значительно упростила генную инженерию.
«Маленькая ранка в ДНК может активировать два разных механизма восстановления в клетках, которые могут использоваться исследователями для принуждения клеток к захвату новой части ДНК в месте ранки» - отметили исследователи.
Считалось, что один из этих методов, называемый негомологичное присоединение концов (NHEJ), часто делает ошибки, и поэтому он редко использовался для вставки новых фрагментов ДНК. Поскольку некоторые ранние работы на мышах показали, что новые фрагменты ДНК могут быть вставлены посредством негомологичного присоединения концов, ученые решили проверить этот метод на человеческих органоидах. Они обнаружили, что вставка любого фрагмента ДНК в органоиды человека при помощи NHEJ более эффективна и надежна, чем второй метод, который использовался ранее. Исследователи назвали свой метод CRISPR-HOT.
Окрашивание клеток
Затем ученые использовали CRISPR-HOT, чтобы вставить флуоресцентные метки в ДНК человеческих органоидов таким образом, чтобы эти метки были прикреплены к определенным генам, которые они хотели изучить. Во-первых, исследователи отметили специфические типы клеток, которые очень редко встречаются в кишечнике (энтероэндокринные клетки). Энтероэндокринные клетки вырабатывают гормоны, чтобы регулировать уровень глюкозы, потребление пищи и очищение желудка. Поскольку эти клетки редки, их сложно изучить. Однако при помощи CRISPR-HOT ученые смогли легко окрасить их в разные цвета, после чего с легкостью идентифицировали и проанализировали их. Во-вторых, исследователи раскрасили органоиды, полученные из специфических типов клеток в печени и желчных протоков. Используя CRISPR-HOT, они визуализировали кератины, белки, участвующие в построение скелета клетки. Благодаря этому они смогли рассмотреть кератины в деталях и в высоком разрешении. Эти кератины также изменяют экспрессию, когда клетки специализируются или дифференцируются. Поэтому исследователи предположили, что CRISPR-HOT может быть полезен для изучения смерти и дифференцировки клеток.
Аномальное деление клеток в печени
В печени находится много гепатоцитов, которые содержат в два и более раз больше ДНК нормальной клетки. Неясно, как эти клетки формируются и способны ли они делиться. У пожилых людей содержится большее количество этих аномальных гепатоцитов, но не понятно, связано ли это с такими заболеваниями как рак.
Ученые использовали CRISPR-HOT для маркировки специфических компонентов механизма деления клеток в органоидах гепатоцитов и изучили процесс деления клеток. Они обнаружили несколько отделов, в которых образовывались аномальные гепатоциты, а также смогли пронаблюдать, как нормальные гепатоциты превращаются в аномальные.
В дополнение к этому ученые изучили влияние мутации, часто встречающейся при раке печени, в гене TP53, на аномальное деление клеток в гепатоцитах. Без TP53 эти патологические гепатоциты делятся гораздо чаще. Это может быть одним из способов, которыми TP53 способствует развитию рака.
Исследователи предположили, CRISPR-HOT может применяться ко многим типам человеческих органоидов, для визуализации любого гена или типа клеток, а также для изучения многих вопросов, связанных с развитием заболеваний.
Источник: https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200302113330.htm
